精原干细胞标记及活体追踪的研究进展

    1994年，Brinster等建立了精原干细胞移植技术，实现了供体小鼠的精原干细胞在受体进行精子发生和单倍体的生殖遗传，这为治疗雄性不育和保护濒危物种提供了一种可能的新途径。但精原干细胞的数量非常少，睾丸中的精原干细胞与全部生殖细胞的比例为2:10000～3:10000，并且随着出生后时间的延长精原干细胞分化形成各级生精细胞。为了提高移植效率，需要将精原干细胞分离出来以达到富集的的；同时为了有效评价移植效率，还要区别受体和供体来源的精原干细胞，这都需要采用有效的标记方法对这些细胞进行标记。从单纯的免疫组织化学技术到直观简单的荧光标记，再到可用于活体示踪的磁共振成像技术，细胞标记技术经历了漫长的发展和改良过程。文章对这些标记技术的原理、优缺点及应用进行了探讨。

1  光镜及电镜的常用标记物质

1.1  胞浆标记物

    常用的精原干细胞胞浆标记物主要有Hoechst、PKH和DiI等。Hoechst是与DNA特异性结合的活性染料，在紫外光激发时发射出明亮的蓝色荧光。用Hoechst33342染精原干细胞时，精原干细胞胞膜表面有ATP BINDING CASSETTE(ABC)蛋白，此蛋白能够将部分染料转移出细胞，表现为细胞核不着色或者很低程度着色，利用流式细胞仪可以将这些不着色的细胞分离，因此能利用免疫荧光激活细胞分选术(FACS)分选精原干细胞。PKH包括发绿色荧光的PKH67和发红色荧光的PKH26，稳定结合于细胞膜的脂质双分子层，产生稳定、清晰、精确和可重复的荧光标记细胞，广泛用于动物、植物细胞和其他含颗粒胞膜细胞的标记，无细胞毒副作用，标记的细胞仍保留生物学和增殖活力，标记时间在100d以上，适合体内外细胞迁移研究。但随着细胞的分裂，标记物也几乎等份地分配给2个子细胞，子细胞的荧光强度也随之下降，只能靠观察到的荧光判断细胞的存在，难以观察细胞形态。PKH26被广泛用于牛、猪、鸡、山羊等动物精原干细胞的标记、追踪方面。DiI是一种亲脂性碳花青染料，容易嵌入生物质膜内并在膜内进行定向扩散从而标记整个细胞。

1.2  核酸标记物

    常用的核酸标记物有4，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)和溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)等。4，6-联脒-2-苯基吲哚是一种显现活细胞或固定细胞DNA的荧光染料，产生的荧光强度与细胞内DNA含量成正比。没结合DNA的4，6-联脒-2-苯基吲哚荧光很弱，而一旦和DNA结合则表现出很强的蓝色荧光，并且对细胞相对无毒，不改变细胞的超微结构。4，6-联脒-2-苯基吲哚最大的优点就是标记技术简单，标记效率很高(起初达100%)，能清楚地观察到被标记的细胞。缺点是细胞分裂将导致4，6-联脒-2-苯基吲哚淬灭及收缩蛋或其他蛋白染色产生的强背景色等引起标记强度降低。4，6-联脒-2-苯基吲哚仅适于短期定量分析，很少在精原干细胞的活体追踪中使用。溴脱氧尿嘧啶核苷是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争掺入S期细胞，只要细胞不消亡，溴脱氧尿嘧啶核苷就在胞核的DNA中长期存留，经免疫组织化学染色可观察到溴脱氧尿嘧啶核苷向细胞内掺入的情况，故溴脱氧尿嘧啶核苷标记和检测的准确性高，标记率高，方法简便、迅速、安全，是反映细胞增殖及跟踪监测移植细胞的理想指标。供体来源的精原干细胞被标记后移植到受体，在受体睾丸中的增殖和分化可以利用抗溴脱氧尿嘧啶核苷抗体免疫组织化学方法进行鉴定。但细胞移植经过一段时间之后，标记细胞如果发生凋亡或死亡，释放的溴脱氧尿嘧啶核苷就可掺入处于S期的任何细胞，溴脱氧尿嘧啶核苷标记的细胞将不仅仅限制在供体细胞内，从而无法区分供体和受体。因此，溴脱氧尿嘧啶核苷仅适合短期标记。

1.3  报告基因标记物

    标记精原干细胞时，常使用绿色荧光蛋白(GFP)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因。绿色荧光蛋白是1962年由Shimomura O等首次从多管水母属中分离纯化得到的，该蛋白能自身催化形成发色团结构且在蓝光激发下还可发出绿色荧光。作为报告基因，绿色荧光蛋白具有分子质量小、能在活细胞中表达、对细胞无毒性的优点；作为荧光标记分子，绿色荧光蛋白具有敏感的标记检测率，并且没有放射性的危害，荧光的产生无需任何底物或辅助因子，可耐受光漂白及甲醛固定，可制成长期保存的标本，因此在精原干细胞的标记和活体追踪中被广泛应用。目前，通行的方法是先以逆转录病毒或慢病毒为载体将绿色荧光蛋白或增强型绿色荧光蛋白转入精原干细胞中，再移植到受体睾丸中(受体可先用白消安或X射线照射除去生精小管中的内源精原干细胞)，移植的精原干细胞在受体睾丸中成活并开始增殖和分化成精子，最终产生绿色荧光蛋白转基因动物。目前，已成功地生产出绿色荧光转基因小鼠。

    除了绿色荧光蛋白之外，1acz基因也是常用的报告基因。1acz基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，是由以Beckwith博士为首的研究小组于l969年首次分离得到的。该基因编码一种由4个亚基组成的四聚体beta-半乳糖苷酶(beta-gal)，该酶能催化乳糖水解，使底物5-溴-4-氯-3-吲哚-beta-半乳糖苷(X-gal)分解产生6种蓝色化合物，从而使转导阳性细胞呈蓝色，而被用作标志基因。用5-溴-4-氯-3-吲哚-beta-半乳糖苷作为底物进行染色时呈蓝色，便于检测和观察，并且对转导细胞的活力及生长无损害。lacz基因的诸多优点使其成为基因工程实验中的一个常用标记基因。

    值得注意的是，经基因修饰的细胞其遗传特性并不稳定，可能在分析正常基因对子代细胞分化方向时产生影响，因而其应用价值有待于进一步评价。

2  活体示踪精原干细胞常用的细胞标记物质

    有关精原干细胞在体内迁徙能力的研究，目前采用的方法多是在移植后的一定时间内先阉割或者处死实验动物，再对睾丸组织进行切片。而这种侵袭性的方法，不能对同一动物精原干细胞在睾丸中迁徙、增殖情况进行动态观察。而且与动物实验不同，精原干细胞移植后组织取材、体外检测不适于人体。故需要用非侵袭性的手段对移入人体内的精原干细胞进行监测。如何在活体监测精原干细胞的存活或分化情况，是各国学者面临的一个共同问题。目前，可以用于精原干细胞移植研究的无创伤性手段主要有以下两种技术：核医学分子显像技术活体示踪精原干细胞和磁共振成像(MRI)活体示踪精原干细胞。

    核医学分子显像技术包括单光子发射计算机断层(SPECT)显像和正电子发射断层(PET)显像。各种组织或细胞都有特异或相对特异的分子标志物，利用适当的放射性核素标记将可以与这些标志物特异结合的分子作为探针，能够在活体显示组织、细胞的存在和状态，并且具有灵敏度高、可定量等优点。这对精原干细胞移植非常重要，尽管在移植前可以在体外对精原干细胞进行富集，但移植到受体睾丸内的精原干细胞数量相对于睾丸组织仍然很少，其分子表达更是微量。

    磁共振成像是Jeff B设计出的一种小的磁性标记，用于追踪受标记的移植细胞在体内的运动信息，从而得知移植细胞的未来命运。磁共振成像是一种非侵入性技术，利用强磁铁和无线电波生成人体组织或一些内部结构的图像，具有多功能、多序列、多参数、多方位成像及较高的软组织分辨力等优点，通过该技术对精原干细胞进行可视化和追踪需要将精原干细胞进行磁性标记以便它们与其他组织有所区别。

3  结语

    有关精原干细胞标记和活体追踪方面的研究虽然取得了一定进展，但尚有许多问题需要解决，尤其是使用核医学分子显像技术和磁共振成像活体示踪精原干细胞还没有重要突破。相信随着科技的发展及相关试验的不断深入，精原干细胞的活体标记检测必定能够得到有效解决。